Реплікація ДНК- Це процес подвоєння батьківських молекул ДНК під час відтворення клітин живих організмів. Тобто процес реплікації передує розподілу клітин. Реплікація, як і транскрипція та трансляція, є матричним процесом. При реплікації ланцюга молекули ДНК розходяться і кожна з них стає матрицею, на якій синтезується новий комплементарний ланцюг. При цьому нуклеотиди нових ланцюгів спаровуються комплементарноз нуклеотидами старих ланцюгів (А Т, Г з Ц). В результаті утворюються дві дочірні двоспіральні молекули ДНК, які не відрізняються від батьківської молекули. Кожна молекула ДНК складається з одного ланцюга вихідної батьківської молекули та одного знову синтезованого ланцюга. Такий механізм копіювання називається напівконсервативним. Кожен знову синтезований ланцюг антипаралельнабатьківської. Синтез одного ланцюга (лідируючою) відбувається безперервно, а інш. (що відстає) – імпульсно. Такий механізм називається напівбезперервним.
Будова реплікативної вилки. Лідируюча нитка, нитка, що відстає, фрагменти Оказаки. див. малюнок.
Ключові ферменти, що у синтезі ДНК.
Загальні структурні риси ДНК-полімераз.
Працюють за одним принципом: подовжують ланцюг ДНК, додаючи до 3-кінця по 1 нуклеотиду. Вибір диктується вимогам компліментарності матричної ДНК. Риси:
Декілька незалежних доменів, кіт. разом нагадують праву руку людини. ДНК зв'язується в невеликій виїмці, утвореній трьома доменами. Основу каталітичного центру утворюють консервативні амінокислотні мотиви у складі домену «долоня». «Пальці» правильним чином мають матрицю в активному центрі. "Великий палець" пов'язує ДНК на виході з ферменту і зумовлює високу процесивність. В активному центрі найважливіші консервативні області всіх трьох доменів зближені та утворюють безперервну поверхню. Екзонуклеазна активність знаходиться у незалежному домені з власним каталітичним центром. N-кінцевий домен впроваджений в екзонуклеазний.
Особливості ДНК-полімерази I.
Бере участь у репарації пошкодженої ДНК, також відіграє допоміжну роль у реплікації ДНК – подовжує 3'-кінець ланцюга, спареного з матричним ланцюгом і дозволяє заповнити прогалини м/д фрагментами відстаючих ланцюгів, подовжує фрагменти Оказаки з 3'-кінців, одночасно видаляючи рибонуклеози затравки, з кіт. починається кожен фрагмент Оказаки. ДНК-полімераза I здатна подовжувати 3'-кінець одного ланцюга в місці розриву в дволанцюжковій ДНК і видаляти нуклеотиди з 5'-кінця того ж розриву (нік-трансляція) - важлива роль в системі репарації.
ДНК-полімеру» I домінує нал усіма іншими. Це оцінний поліпептид масою 103 кДа, який може бути розщеплений на 2 частини: С-кінцевий фрагмент, 68 кДа, фрагмент Кленова, обкладає полімеразною і 3'->5" екзонуклеазними активностями; >3" екзонуклеазною активністю.
Холофермент, ДНК-полімераза III, реплісома.
Холофермент є комплексом масо1 900кДа, що містить 10 білків, підрозділених на 4 типи субкомплексів:
α, ξ, θ. Містить дві копії каталітичної серцевини. α – ДНК-полімеразна активність, ξ – 3'-екзонуклеазна активність, θ – стимулює екзонуклеазу.
Містить 2 субодиниці τ (тау) – служать для скріплення мінімального ферменту, що має каталітичну активність (α).
2 копії затиску (clamp) – відповідають за утримання мінімального ферменту на ДНК-матриці. Кожен складається з гомодимеру субодиниць β. Головна роль – звести до мінімуму ймовірність відокремлення ферменту від матриці, перш ніж завершиться процес копіювання.
γ – група із 5 білків, кіт. утворюють клемп-лоудер – пристосування для накладання затиску на матрицю ДНК. Складається з 2 δ, 1 γ, 1 ψ і 1 χ - субодиниць.
Реплісома - мультиферментний комплекс у бактеріальній вилці, що здійснює процес напівконсервативної реплікації; містить ДНК-полімеразу та ряд ін. білків.
ДНК-полімерази еукаріотів.
ДНК-полімераза α – ініціює синтез нового ланцюга та відстаючого. Асоційована з β-субодиницею та двома невеликими білками з праймазною активністю, тому може синтезувати ланцюги заново. 2 функції: затравка та подовження = α-праймазу.
ДНК-полімераза δ – елонгує провідний ланцюг
ДНК-полімераза ξ – бере участь у синтезі ланцюга, що відстає
ДНК-лігази.
Необхідні для з'єднання ланцюгів ДНК при реплікації, репарації, рекомбінації. ДНК-лігази E.coli та фага Т4 – поодинокі пептиди, здатні з'єднувати кінці двох різних дуплексних фрагментів або розірвані кінці ланцюгів лінійної чи кільцевої ДНК. Т.ч., за допомогою ДНК-лігаз можуть утворюватися і лінійні та кільцеві дуплексні молекули ДНК.
ДНК-хелікази.
Здійснює розплітання ланцюгів, використовуючи енергію гідролізу АТФ. Функціонує у складі комплексу, що здійснює переміщення реплікативної вилки та реплікацію розплетених ланцюгів. Для збільшення швидкості кілька зеліказів можуть діяти спільно.
SSB-білки.
Однониткові білки, що зв'язують, дестабілізують спіраль, зв'язуються з одноланцюжковою ділянкою, тим самим її стабілізують, тобто. фіксують ділянку одноланцюгової ДНК.
ДНК-топоізомеразиIіII, гіраза.
При розплетенні ДНК відбувається обертання молекули – зміна вторинної та третинної структур. Ці процеси каталізує група ферментів, які називають топоізомеразами. Вони вносять одне і дволанцюгові розриви в ДНК, що дозволяє молекулі нуклеїнової кислоти обертатися і ставати матрицею. За механізмом дії розрізняють топоізомерази першого (І) та другого (ІІ) типів.
Топоізомерази типу I (у Е. coli – свівелаза) – вносять одноланцюжковий розрив у молекулу ДНК, топоізомерази типу II (у Е. coli – гіраза) – здійснюють дволанцюжковий розрив ДНК та перенесення ниток ДНК через розрив з подальшим їх зшиванням. При цьому здійснюючи свої функції, топізомерази залишаються пов'язаними з молекулою ДНК. У цих процесах топоізомеразами використовується залишок тирозину, який здійснює нуклеофільних атак фосфатної групи ДНК з утворенням фосфотирозину. В результаті ферменти виявляються ковалентно пов'язаними з 5'- або 3'-кінцями ДНК у місці розриву. Утворення такого ковалентного зв'язку унеможливлює витрати енергії при відновленні фосфодіефірного зв'язку в одноланцюжковому розриві на заключних стадіях реакції. ДНК-топоізомераз типу I має один каталітичний залишок тирозину на молекулу мономерного білка, тоді як димери ДНК-топоізомераз II містять по одному каталітичному залишку на кожну субодиницю, що забезпечує створення ступінчастого дволанцюжкового розриву в молекулі ДНК.
Топоізомерази виконують функції шарнірів, проте їх дії протилежні. Топоізомерази I, розриваючи один з кіл кільцевої суперспіралізованої ДНК, розкручують ланцюги і зменшують число супервитків. Топоізомерази II перетворюють розслаблену ненадспіралізовану замкнуту кільцеву ДНК на суперспіраль.
Стадії реплікації: ініціація, елонгація, термінація. Ініціація утворення нових ланцюгів ДНК. Праймаз. Праймосома. Термінація реплікації ДНК та розбіжність дочірніх спіралей у прокаріотів.
Термінація реплікації у лінійних геномах. Проблема реплікації лінійного незамкнутого фрагмента ДНК. Теломери та повтори, петля. Теломераза. Механізм роботи теломерази. Особливості реплікації ДНК еукаріотів. Реплікони еукаріотів.
Як і у випадку біосинтезу інших макромолекул клітини, процес реплікації умовно поділяють на три основні етапи: ініціацію, елонгацію та термінацію.
Реплікація прокаріотів
Ініціація
Хромосома прокаріотів найчастіше представлена одиничною суперскрученою кільцевою молекулою з одним або двома сайтами початку реплікації.Для того, щоб кожен з двох ланцюгів ДНК став матрицею, для синтезу нового ланцюга, необхідно, щоб нитки ДНК розправилися і відійшли один від одного. Встановлено, що ланцюги ДНК розкручуються не всією довжиною, але в короткому ділянці. Тут утворюється вилка реплікації – місце подвоєння ДНК.
При розплетенні ДНК відбувається обертання молекули – зміна вторинної та третинної структур. Ці процеси каталізує група ферментів, які називаються топоізомеразами . Вони вносять одне і дволанцюгові розриви в ДНК, що дозволяє молекулі нуклеїнової кислоти обертатися і ставати матрицею. За механізмом дії розрізняють топоізомерази першого (І) та другого (ІІ) типів.
На розплетену ділянку батьківської молекули ДНК, з якої починається реплікація і яка називається точкою початку реплікації (або ориджином, oriС) «сідають» ініціаторні білки. Ініціація реплікації в oriC починається з формування комплексу, до якого входять шість білків DnaA, DnaB, DnaC, HU, гіраза та SSB.
Спочатку з дев'ятинуклеотидною послідовністю зв'язуються білки DnaA які формують великий агрегат. ДНК ориджина оперізує його, і ланцюги ДНК роз'єднуються в області трьох 13-членних послідовностей. На наступному етапі приєднуються білки DnaB (хеліказу) та DnaC, формуючи агрегат розміром 480 кДа, з радіусом 6 нм. Хеліказа/ DnaB забезпечує розрив водневих зв'язків між азотистими основами подвійного ланцюга ДНК, приводячи до її денатурації, тобто. розбіжності ниток.
В результаті випрямлення та денатурації подвійної спіралі ДНК формується вилка реплікації, що має Y-подібну форму (рис). Саме у цій реплікаційній вилці ДНК-полімерази синтезують дочірні молекули ДНК. Така ділянка ДНК виглядає як бульбашка або «вічко» у нереплікованій ДНК. Реплікаційні «вічка» утворюються у тих місцях, де знаходяться точки початку реплікації. Коли ланцюги ДНК роз'єднані, молекула стає досить рухливою. Усі можливі порушення у структурі одиночних ланцюгів виключаються завдяки дії білків SSВ
(single-strand DNA-binding proteins або helix-destabilizing proteins), які, зв'язуючись з одиночними ланцюгами ДНК, перешкоджають їх злипанню. 
Є молекулою спадковості, то для реалізації цієї якості вона повинна точно копіювати саму себе і таким чином зберігати всю інформацію, що є у вихідній молекулі ДНК, у вигляді певної послідовності нуклеотидів. Це забезпечується за рахунок особливого процесу, що передує розподілу будь-якої клітини організму, який називається реплікацією ДНК.
Суть реплікації днк у тому, що спеціальний фермент розриває слабкі водневі зв'язку, які з'єднують між собою нуклеотиди двох ланцюгів. В результаті ланцюга ДНК роз'єднуються, і з кожного ланцюга стирчать вільні азотисті підстави (виникнення так званої вилки реплікації). Особливий фермент ДНК-полімераза починає рухатися вздовж вільного ланцюга ДНК від 5- до З-кінцю (лідируючий ланцюг), допомагаючи приєднатися вільним нуклеотидам, що постійно синтезуються в клітці, до З"-кінця знову синтезованого ланцюга ДНК. На другій нитці ДНК (нитка, що відстає) ) нова ДНК утворюється у вигляді невеликих сегментів, що складаються з 1000-2000 нуклеотидів (фрагменти Оказаки).
Для початку реплікації днк фрагментів цієї нитки потрібен синтез коротких фрагментів РНК (про характерні особливості РНК буде сказано нижче) як затравок, для чого використовується особливий фермент – РНК-полімераза (праймаза). Згодом праймери РНК видаляються, в проломи, що утворилися, вбудовується ДНК за допомогою ДНК полімерази I. Таким чином, кожен ланцюг ДНК використовується як матриця або шаблон для побудови комплементарного ланцюга і реплікація ДНК є напівконсервативною (тобто одна нитка в новій молекулі ДНК - «стара », а друга - нова).
Для реплікації лідируючої та відстаючої ланцюгів клітиною використовують різні ферменти. В результаті реплікації утворюються дві нові абсолютно ідентичні молекули ДНК, ідентичні також вихідної молекули ДНК до початку її редуплікації (детальніше процес реплікації ДНК показаний на рис. 3.5). ДНК-полімераза, як і будь-який інший фермент, істотно прискорює процес приєднання комплементарних нуклеотидів до вільного ланцюга ДНК, однак хімічна спорідненість аденіну до тиміну, а цитозину до гуаніну настільки велика, що вони з'єднуються один з одним і відсутність ДНК-полімерази у простій реакційній суміші.
Можна сказати, дещо спрощуючи, що феномен точного подвоєння молекули ДНК, в основі якого лежить комплементарність основ цієї молекули, становить молекулярну основу спадковості. Швидкість реплікації ДНК у людини відносно низька і для того, щоб забезпечити реплікацію ДНК будь-якої хромосоми людини, були б потрібні тижні, якби реплікація починалася з однієї точки. Насправді в молекулі ДНК будь-якої хромосоми, а кожна хромосома людини містить тільки одну молекулу ДНК, є безліч місць ініціації реплікації (репліконів). Від кожного реплікона реплікація йде в обох напрямках доти, доки сусідні реплікони не зливаються. Тому реплікація ДНК у кожній хромосомі протікає відносно швидко.
Реплікація (від латів. replicatio - відновлення) - процес синтезу дочірньої молекули ДНК на матриці батьківської молекули ДНК. У ході подальшого поділу материнської клітини кожна дочірня клітина отримує по одній копії молекули ДНК, яка є ідентичною ДНК вихідної материнської клітини. Цей процес забезпечує точну передачу генетичної інформації з покоління до покоління. Реплікацію ДНК здійснює складний ферментний комплекс, що складається з 15-20 різних білків, званий реплісомою (англ. replisome)
Реплікація ДНК - ключова подія під час поділу клітини. Принципово, щоб на момент поділу ДНК була реплікована повністю і лише один раз. Це забезпечується певними механізмами регулювання реплікації ДНК.
Реплікація проходить у три етапи:
1. Ініціація реплікації
2. Елонгація
3. Термінація реплікації.
Регуляція реплікації здійснюється переважно на етапі ініціації. Це досить легко здійснимо, тому що реплікація може починатися не з будь-якої ділянки ДНК, а з певного, званого сайтом ініціації реплікації. У геномі таких сайтів може бути лише один, так і багато. З поняттям сайту ініціації реплікації тісно пов'язане реплікон. Реплікон – це ділянка ДНК, яка містить сайт ініціації реплікації та реплікується після початку синтезу ДНК із цього сайту. Геноми бактерій, як правило, є одним репліконом, це означає, що реплікація всього геному є наслідком всього одного акта ініціації реплікації.
Геноми еукаріотів (а також їх окремі хромосоми) складаються з великої кількості самостійних репліконів, це значно скорочує сумарний час реплікації окремої хромосоми. Молекулярні механізми, які контролюють кількість актів ініціації реплікації у кожному сайті за один цикл поділу клітини, називаються контролем копійності. У бактеріальних клітинах, крім хромосомної ДНК, часто містяться плазміди, які являють собою окремі реплікони. У плазмід існують свої механізми контролю копійності: вони можуть забезпечувати синтез як однієї копії плазміди за клітинний цикл, так і тисяч копій.
Реплікація починається на сайті ініціації реплікації з розплетення подвійної спіралі ДНК, у своїй формується реплікаційна вилка — місце безпосередньої реплікації ДНК. У кожному сайті може формуватися одна чи дві реплікаційні вилки залежно від того, чи є реплікація одно- чи двонаправленою. Найбільш поширена двонаправлена реплікація. Через деякий час після початку реплікації в електронний мікроскоп можна спостерігати реплікаційне вічко — ділянку хромосоми, де ДНК вже реплікована, оточена більш протяжними ділянками нереплікованої ДНК.
У реплікаційній вилці ДНК копіює великий білковий комплекс (реплісома), ключовим ферментом якого є ДНК-полімераза. Реплікаційна вилка рухається зі швидкістю близько 100 000 пар нуклеотидів за хвилину у прокаріотів і 500-5000 - у еукаріотів.
Молекулярний механізм реплікації:
Ферменти (хеліказу, топоізомеразу) і ДНК-зв'язуючі білки розплітають ДНК, утримують матрицю в розведеному стані і обертають молекулу ДНК. Правильність реплікації забезпечується точною відповідністю комплементарних пар основ та активністю ДНК-полімерази, здатної розпізнати та виправити помилку. Реплікація у еукаріотів здійснюється декількома різними ДНК-полімеразами (на відміну від реплікації ДНК у прокаріотів).
ДНК-полімераза I діє на ланцюгу, що запізнюється, для видалення РНК-праймерів і дореплікації очищених місць ДНК. ДНК полімераза III - основний фермент реплікації ДНК, що здійснює синтез провідного ланцюга ДНК і фрагментів Оказаки при синтезі ланцюга, що запізнюється (фрагменти Оказаки - відносно короткі фрагменти ДНК, які утворюються на відстаючої ланцюга в процесі реплікації ДНК). Далі відбувається закручування синтезованих молекул за принципом суперспіралізації та подальшої компактизації ДНК. Синтез енерговитратний.
Ланцюги молекули ДНК розходяться, утворюють реплікаційну вилку, і кожна з них стає матрицею, на якій синтезується новий комплементарний ланцюг. В результаті утворюються дві нові двоспіральні молекули ДНК, ідентичні батьківській молекулі.
Реплікація- Передача інформації від ДНК до ДНК, самоподвоєння ДНК (біосинтез ДНК).
Молекула ДНК, що складається з двох спіралей, подвоюєтьсяпри розподілі клітини. Подвоєння ДНКґрунтується на тому, що при розплетенні ниток до кожної нитки можна добудувати комплементарну копіютаким чином, одержуючи дві нитки молекули ДНК, що копіюють вихідну.
Умови необхідні реплікації: 1.) Матриця- нитки ДНК. Розщеплення нитки називається реплікативна вилка. Вона може утворюватися усередині молекули ДНК. Вони рухаються у різних напрямках, утворюючи реплікативне вічко. Таких вічок у молекулі ДНК еукаріотів кілька, кожен має дві вилки. 2.) Субстрат. Пластичним матеріалом є дезоксинуклеотидтрифосфати: дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ. Потім відбувається їхній розпад до дезоксинуклеотидмонофосфатів, двох молекул неорганічного фосфату з виділенням енергії, тобто. вони одночасно є джерелом і енергії, і пластичного матеріалу. 3.) Іони магнію. 4.) Реплікативний комплекс ферментів. а) ДНК - білки, що розкручують: - DNA-A(викликає розбіжність ниток); - Хелікази(розщеплюють ланцюг ДНК); - топоізомерази 1і 2 (Розкручують понад спіралі). Розривають (3",5")-фосфодіефірні зв'язки. Топоізомераза 2 у прокаріотів називається гіраза. б) Білки, що перешкоджають з'єднанню ниток ДНК ( SSB-білки). в) ДНК-полімераза(Каталізує утворення фосфодіефірних зв'язків). ДНК-полімераза лише подовжує вже існуючу нитку, але не може з'єднати два вільні нуклеотиди. г) Праймаза(Каталізує утворення «затравки» до синтезу). Це за своєю структурою РНК-полімераза, яка поєднує одиночні нуклеотиди. д) ДНК-лігаза. 5.) Праймери- "затравка" для реплікації. Це короткий фрагмент, що складається з рибонуклеотидтрифосфатів(2 – 10). Освіта праймерів каталізується праймазою.
Етапи реплікації: 1.) Ініціація(Утворення реплікативної вилки); 2.) Елонгація(синтез нових ниток); 3.) Виключення праймерів; 4.) Термінація(Завершення синтезу двох дочірніх ланцюгів).
Ініціація реплікації:- регулюють сигнальні білкові молекули – фактори зростання;- забезпечують ферментиі спеціальні білки.
Необхідні ферменти: ДНК-топоізомерази- ферменти, що розкручують суперспіралі ДНК. ДНК-хеліказу– здійснює розрив водневих зв'язків у молекулі дволанцюжкової ДНК. В результаті утворюється реплікативна вилка (реплікативне вічко).
Білки, що зв'язуються з одноланцюжковими нитками ДНК, зв'язуються з одноланцюжковими ДНК і перешкоджають їхньому комплементарному з'єднанню.
Елонгація реплікації.Субстратами синтезу є дезоксинуклеозидтрифосфати, що виконують роль будівельного матеріалу та джерел енергії.
Необхідні ферменти: ДНК-праймазуякий каталізує синтез коротких молекул РНК-затравок для ДНК-полімерази. ДНК-полімеразазабезпечує включення до зростаючого «нового» ланцюга нуклеотидів комплементарних «старого», тобто матричного ланцюга.
Синтез нових ланцюгів ДНК може протікати лише у напрямку від 5'-кінця у бік 3'-кінця. На одному ланцюгу ДНК синтезується безперервно «лідируючий» ланцюг, а на іншій утворюються короткі фрагменти - «ланцюг, що запізнюється» (фрагменти Козаки).
Після видалення праймерів ДНК-лігазазшиває короткі фрагменти Оказаки між собою ( термінація).
Інформація передається матричним способом. НапівконсервативнийМеханізм реплікації ДНК.
| Синтез відстаючого ланцюга |
| 3’ |
| 3’ |
| 5’ |
| 5’ |
ДНК є надійним сховищем генетичної інформації. Але її потрібно не тільки тримати в безпеці, а й передавати потомству. Від цього залежить виживання виду. Адже батьки мають передати дітям усе те, чого вони досягли під час еволюції. У ній записано все: починаючи з кількості кінцівок і закінчуючи кольором очей. Звісно, у мікроорганізмів цієї інформації набагато менше, але її потрібно передати. Для цього клітка ділиться. Щоб генетична інформація дісталася обом дочірнім клітинам, її треба подвоїти, цей процес називається "реплікація ДНК". Вона відбувається перед поділом клітини, не має значення, який саме. Це може бути бактерія, яка вирішила розмножитись. Або це може бути зростання нової шкіри на місці порізу. Процес подвоєння дезоксирибонуклеїнової кислоти повинен чітко відрегулюватись і завершитися до початку розподілу клітини.
Де відбувається подвоєння
Реплікація ДНК відбувається безпосередньо в ядрі (у еукаріотів) або в цитоплазмі (у прокаріотів). Нуклеїнова кислота складається з нуклеотидів - аденіну, тиміну, цитозину та гуаніну. Обидва ланцюжки молекули побудовані за принципом компліментарності: аденіну в одному ланцюзі відповідає тімін, а гуаніну – цитозин. Подвоєння молекули має пройти в такий спосіб, щоб у дочірніх спіралей зберігся принцип компліментарності.
Початок реплікації – ініціація
Дезоксирибонуклеїнова кислота є дволанцюжковою спіралью. Реплікація ДНК відбувається шляхом добудовування дочірніх кіл по кожному батьківському ланцюжку. Щоб цей синтез став можливим, спіралі потрібно «розплутати», а ланцюжки відокремити один від одного. Цю роль виконує геліказа – вона розкручує спіраль дезоксирибонуклеїнової кислоти, обертаючись із великою швидкістю. Початок подвоєння ДНК не може розпочатися з будь-якого місця, такий складний процес вимагає певної ділянки молекули – сайту ініціації реплікації. Після того, як була визначена початкова точка подвоєння, а геліказа почала свою роботу з розплутування спіралі, ланцюжки ДНК розходяться в сторони, утворюючи реплікативну вилку. На них сідають ДНК-полімерази. Саме вони й синтезуватимуть дочірні ланцюжки.
Елонгація
В одній молекулі дезоксирибонуклеїнової кислоти може утворитися від 5 до 50 реплікативних виделок. Синтез дочірніх ланцюжків відбувається одночасно у кількох ділянках молекули. Але це складно добудування компліментарних нуклеотидів. Ланцюжки нуклеїнової кислоти антипаралельні один одному. Різна спрямованість батьківських ланцюгів дається взнаки при подвоєнні, це зумовило складний механізм реплікації ДНК. Один з ланцюгів добудовується дочірньою безперервно і називається лідируючою. Воно і правильно, адже полімеразі дуже зручно приєднувати вільний нуклеотид до 3'-ВІН кінця попереднього. Такий синтез йде безперервно, на відміну від процесу другого ланцюга.
Ланцюг, що запізнюється, фрагменти О’Козаки
З іншим ланцюжком виникають складності, адже там вільним виявляється 5'-кінець, до якого неможливо прикріпити вільний нуклеотид. Тоді ДНК полімеразу діє з іншого боку. Для того щоб добудувати дочірній ланцюжок, створюється праймер, компліментарний для батьківського ланцюга. Він утворюється біля самої реплікативної виделки. З нього і починається синтез маленького шматочка, але вже «правильним» шляхом - приєднання нуклеотидів відбувається до 3'-кінця. Таким чином, добудовування ланцюжка у другої дочірньої спіралі відбувається уривчасто і має напрямок, протилежний руху реплікативної вилки. Ці фрагменти були названі фрагментами О'Козаки, вони мають довжину близько 100 нуклеотидів. Після того як фрагмент добудувався до попереднього готового шматочка, праймери вирізаються спеціальним ферментом, місце вирізу заповнюється нуклеотидами, що відсутні.
Термінація
Подвоєння завершується, коли обидва ланцюжки добудували собі дочірні, а всі фрагменти О'Козаки пошиті між собою. У еукаріотів реплікація ДНК закінчується, коли реплікативні виделки зустрічаються один з одним. А у прокаріотів ця молекула кільцева, а процес її подвоєння відбувається без попереднього розриву ланцюга. Виходить, що вся дезоксирибонуклеїнова кислота є одним репліконом. І подвоєння закінчується тоді, коли реплікативні виделки трапляються на протилежному боці кільця. Після закінчення реплікації обидва ланцюжки батьківської дезоксирибонуклеїнової кислоти повинні бути зчеплені назад, після чого обидві молекули закручуються до утворення суперспіралей. Далі відбувається метилювання обох молекул ДНК по аденіну в ділянці -ГАТЦ-. Це не роз'єднує ланцюги та не заважає їх компліментарності. Це необхідно для складання молекул у хромосоми, а також для регуляції читання генів.
Швидкість та точність реплікації
Друга стадія подвоювання ДНК (елонгація) відбувається зі швидкістю близько 700 нуклеотидів на секунду. Якщо згадати, що на один виток нуклеїнової кислоти припадає 10 пар мономерів, то виходить, що під час «розплетення» молекула обертається із частотою 70 обертів на секунду. Для порівняння: швидкість обертання кулера у системному блоці комп'ютера становить приблизно 500 обертів на секунду. Але незважаючи на високі темпи, ДНК полімераз практично ніколи не помиляється. Адже вона просто вибирає компліментарні нуклеотиди. Але навіть якщо вона робить помилку, ДНК-полімераза її розпізнає, робить крок назад, відриває неправильний мономер і замінює його вірним. Механізм реплікації ДНК є дуже складним, але основні моменти ми змогли розібрати. Важливо розуміти його значення як мікроорганізмів, так багатоклітинних істот.
Реплікація ДНК- Це процес її подвоєння перед розподілом клітини. Іноді кажуть "редуплікація ДНК". Подвоєння відбувається у S-фазі інтерфази клітинного циклу.
Очевидно, що самокопіювання генетичного матеріалу в живій природі є потребою. Тільки так дочірні клітини, що утворюються при розподілі, можуть містити стільки ж ДНК, скільки його спочатку було у вихідній. Завдяки реплікації всі генетично запрограмовані особливості будови та метаболізму передаються у ряді поколінь.
У процесі поділу клітини кожна молекула ДНК із пари ідентичних відходить у свою дочірню клітину. Таким чином, забезпечується точна передача спадкової інформації.
При синтезі ДНК споживається енергія, тобто це енерговитратний процес.
Механізм реплікації ДНК
Молекула ДНК як така (без подвоєння) є подвійну спіраль. У процесі редуплікації водневі зв'язки між двома комплементарними ланцюгами розриваються. І на кожному окремому ланцюгу, який тепер служить шаблоном-матрицею, будується новий компліментарний їй ланцюг. Таким чином, утворюються дві молекули ДНК. У кожної один ланцюг дістається їй від материнської ДНК, другий - знову синтезований. Тому механізм реплікації ДНК є напівконсервативним(один ланцюг старий, один новий). Такий механізм реплікації було доведено 1958 року.
У молекулі ДНК ланцюги антипаралельні. Це означає, що одна нитка йде у напрямку від 5" кінця до 3", а комплементарна їй навпаки. Цифри 5 та 3 позначають номери атомів вуглецю в дезоксирибозі, що входить до складу кожного нуклеотиду. Через ці атоми нуклеотиди пов'язані між собою фосфодіефірними зв'язками. І там, де в одного ланцюга 3" зв'язки, в іншого - 5", оскільки він перевернутий, тобто йде в іншому напрямку. Для наочності можна припустити, що ви поклали руку на руку, як першокласник, що сидить за партою.
Основний фермент, який виконує нарощування нової нитки ДНК, здатний це робити лише в одному напрямку. А саме: приєднувати новий нуклеотид тільки до 3" кінця. Таким чином, синтез може йти тільки в напрямку від 5" до 3".
Ланцюги антипаралельні, отже синтез повинен йти на них у різних напрямках. Якби ланцюга ДНК спочатку повністю розходилися, а потім на них уже будувалася нова комплементарна, то це не було б проблемою. Насправді ж ланцюги розходяться у певних точках початку реплікації, і у цих місцях на матрицях відразу починається синтез.
Формуються так звані реплікаційні вилки. При цьому на одному материнському ланцюгу синтез йде у бік розходження вилки, і цей синтез відбуватиметься безперервно, без розривів. На другій матриці синтез йде у зворотний бік від напрямку розбіжності ланцюгів вихідної ДНК. Тому такий зворотний синтез може йти лише шматками, які називаються фрагментами Оказаки. Пізніше такі фрагменти "зшиваються" між собою.
Дочірній ланцюг, який реплікується безперервно, називається лідируючою, або провідною. Та, яка синтезується через фрагменти Оказаки, - запізнювальною або відстаючоюоскільки фрагментарна реплікація виконується повільніше.
На схемі нитки батьківської ДНК поступово розходяться у напрямі, у якому йде синтез провідного дочірнього ланцюга. Синтез відстаючого ланцюга йде у зворотний розбіжності бік, тому змушений виконуватися шматками.
Інший особливістю основного ферменту синтезу ДНК (полімерази) і те, що не може сам розпочати синтез, лише продовжити. Йому необхідна затравка, або праймер. Тому на батьківській нитці спочатку синтезується невелика комплементарна ділянка РНК, потім вже відбувається нарощування ланцюга за допомогою полімерази. Пізніше праймери віддаляються, дірки забудовуються.
На схемі затравки показані тільки на ланцюгу, що відстає. Насправді вони є і на лідируючій. Однак тут потрібний лише один праймер на вилку.
Оскільки ланцюги материнської ДНК не завжди розходяться з кінців, а в точках ініціалізації, то насправді формуються не так виделки, скільки вічка, або бульбашки.
У кожному міхурі може бути дві вилки, тобто ланцюги будуть розходитися у двох напрямках. Однак можуть лише в одному. Якщо все ж таки розбіжність двонаправлена, то з точки ініціалізації на одній нитці ДНК синтез йтиме у двох напрямках - вперед і назад. При цьому в один бік виконуватиметься безперервний синтез, а в інший – фрагментами Оказаки.
ДНК прокаріотів не лінійна, а має кільцеву структуру і лише одну точку початку реплікації.
На схемі червоним та синім кольором показано дві нитки батьківської молекули ДНК. Нові нитки, що синтезуються, показані пунктиром.
У прокаріотів самокопіювання ДНК виконується швидше, ніж у еукаріотів. Якщо швидкість редуплікації в еукаріотів становить сотні нуклеотидів в секунду, то у прокаріотів досягає тисячі і більше.
Ферменти реплікації
Реплікацію ДНК забезпечує цілий комплекс ферментів, що називається реплісомою. Усього ферментів та білків реплікації понад 15. Нижче перераховані найбільш значущі.
Основним ферментом реплікації є вже згадана ДНК-полімераза(насправді є кілька різних), яка безпосередньо здійснює нарощування ланцюга. Не єдина функція ферменту. Полімераза здатна «перевіряти», який нуклеотид намагається приєднатися до кінця. Якщо невідповідний, вона його видаляє. Інакше кажучи, часткова репарація ДНК, т. е. її виправлення помилок реплікації, відбувається на етапі синтезу.
Нуклеотиди, що знаходяться в нуклеоплазмі (або цитоплазмі у бактерій), існують у формі трифосфатів, тобто це не нуклеотиди, а дезоксинуклеозидтрифосфати (дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ). Вони схожі на АТФ, у якої три фосфатні залишки, два з яких пов'язані макроергічним зв'язком. При розриві таких зв'язків виділяється багато енергії. Також і у дезоксинуклеозидтрифосфатів два макроергічні зв'язки. Полімераза відокремлює два останні фосфати і використовує енергію, що виділяється на реакцію полімеризації ДНК.
Фермент Хеліказаподіляє нитки матричної ДНК, розриваючи водневі зв'язки між ними.
Оскільки молекула ДНК є подвійною спіраль, то розрив зв'язків провокує ще більше її скручування. Уявіть канат із двох закручених щодо один одного мотузок, і ви з одного боку за кінці тягнете одну праворуч, іншу – ліворуч. Сплетена частина стане ще більше скручуватися, буде тугішою.
Для усунення подібної напруги необхідно, щоб подвійна спіраль, що ще не розійшлася, швидко крутилася навколо своєї осі, «скидаючи» надспіралізацію, що виникає. Однак це надто енерговитратно. Тому у клітинах реалізується інший механізм. Фермент топоізомеразурозриває одну з ниток, пропускає через розрив другою і знову зшиває першу. Чим і усуваються супервітки, що виникають.
Хелікази нитки матричної ДНК, що розійшлися в результаті дії, намагаються знову з'єднатися своїми водневими зв'язками. Щоб цього не сталося, набувають чинності ДНК-зв'язуючі білки. Не ферменти тому розумінні, що реакцій де вони каталізують. Такі білки прикріплюються до нитки ДНК на її протязі і не дають комплементарним ланцюгам матричної ДНК зімкнутися.
Праймери синтезуються РНК-праймазою. А віддаляються екзонуклеазою. Після видалення праймера "дірку" забудовує інший тип полімерази. Однак при цьому окремі ділянки ДНК не зшиваються.
Окремі частини синтезованого ланцюга зшиваються таким ферментом реплікації як ДНК-лігаза.
