replikácia DNA je proces zdvojenia rodičovských molekúl DNA počas rozmnožovania buniek živých organizmov. To znamená, že proces replikácie predchádza bunkovému deleniu. Replikácia, podobne ako transkripcia a preklad, je matricový proces. Počas replikácie reťazca sa molekuly DNA rozchádzajú a každá z nich sa stáva templátom, na ktorom sa syntetizuje nový komplementárny reťazec. V tomto prípade sú nukleotidy nových reťazcov spárované komplementárne s nukleotidmi starých reťazcov (A s T, G s C). Výsledkom je, že sa vytvoria dve dcérske dvojvláknové molekuly DNA na nerozoznanie od rodičovskej molekuly. Každá molekula DNA pozostáva z jedného vlákna pôvodnej rodičovskej molekuly a jedného novosyntetizovaného vlákna. Tento kopírovací mechanizmus je tzv polokonzervatívne. Každý novo syntetizovaný reťazec antiparalelné rodičovský. Syntéza jedného reťazca (vedúceho) prebieha nepretržite a druhá (zaostávajúca) - pulzná. Tento mechanizmus sa nazýva polokontinuálne.
Štruktúra replikačnej vidlice. Vodiaca niť, zaostávajúca niť, úlomky Okazaki. pozri obrázok.
Kľúčové enzýmy zapojené do syntézy DNA.
Všeobecné štruktúrne vlastnosti DNA polymeráz.
Fungujú na rovnakom princípe: predlžujú reťazec DNA pridaním 1 nukleotidu na 3' koniec. Výber je diktovaný požiadavkami na komplementaritu templátovej DNA. Vlastnosti:
Niekoľko nezávislých domén, kat. spolu pripomínajú pravú ruku človeka. DNA sa viaže v malej priehlbine tvorenej tromi doménami. Základ katalytického centra tvoria konzervované aminokyselinové motívy v palmovej doméne. „Prsty“ správne umiestnia matricu do aktívneho stredu. „Palec“ viaže DNA na výstupe z enzýmu a spôsobuje vysokú procesivitu. V aktívnom centre sú najdôležitejšie konzervované oblasti všetkých troch domén spojené a tvoria súvislý povrch. Aktivita exonukleázy sa nachádza v nezávislej doméne s vlastným katalytickým miestom. N-koncová doména je vložená do exonukleázovej domény.
Vlastnosti DNA polymerázy I.
Podieľa sa na oprave poškodenej DNA, hrá tiež pomocnú úlohu pri replikácii DNA - predlžuje 3' koniec vlákna spárovaného s templátovým vláknom a umožňuje vyplniť medzery m/d fragmentmi zaostávajúcich vlákien, predlžuje Okazakiho fragmenty z 3' koncov, pričom sa súčasne odstránia semená ribonukleozidov RNA, s kat. každý fragment Okazaki začína. DNA polymeráza I je schopná predĺžiť 3' koniec jedného vlákna pri zlome v dvojvláknovej DNA a odstrániť nukleotidy z 5' konca toho istého zlomu (nick translácia) - dôležitá úloha v opravnom systéme.
DNA polymér“ dominujem nad všetkými ostatnými. Ide o 103 kDa polypeptid, ktorý je možné rozštiepiť na 2 časti: C-koncový fragment, 68 kDa, Klenowov fragment, má polymerázové a 3'->5" exonukleázové aktivity; fragment N-coin, 35 kDa, má 5' ->3" exonukleázová aktivita.
Holoenzým, DNA polymeráza III, replikóm.
Holoenzým je 900 kDa komplex obsahujúci 10 proteínov rozdelených do 4 typov subkomplexov:
α, ξ, θ. Obsahuje 2 kópie katalytického jadra. α – aktivita DNA polymerázy, ξ – aktivita 3’-exonukleázy, θ – stimuluje exonukleázu.
Obsahuje 2 podjednotky τ (tau) - slúžia na držanie minimálneho enzýmu s katalytickou aktivitou (α).
2 kópie svorky – zodpovedné za držanie minimálneho enzýmu na templátoch DNA. Každý pozostáva z homodiméru β podjednotiek. Hlavnou úlohou je minimalizovať pravdepodobnosť oddelenia enzýmu od matrice pred dokončením procesu kopírovania.
γ – skupina 5 bielkovín, pol. tvoria svorku-nakladač - zariadenie na aplikáciu svorky na matricu DNA. Pozostáva z 2 δ, 1 γ, 1 ψ a 1 χ podjednotiek.
Replisome je multienzýmový komplex v bakteriálnej replikačnej vidlici, ktorý vykonáva proces semikonzervatívnej replikácie; obsahuje DNA polymerázu a množstvo ďalších proteínov.
Eukaryotické DNA polymerázy.
DNA polymeráza α - iniciuje syntézu nového vlákna a zaostávajúceho vlákna. Je spojený s β-podjednotkou a dvoma malými proteínmi s primárnou aktivitou, takže môže syntetizovať reťazce nanovo. 2 funkcie: priming a extenzia = α-primáza.
DNA polymeráza δ – predlžuje vedúci reťazec
DNA polymeráza ξ – podieľa sa na syntéze zaostávajúceho vlákna
DNA ligázy.
Nevyhnutné na spájanie reťazcov DNA počas replikácie, opravy a rekombinácie. DNA ligázy z E. coli a fágu T4 sú jednotlivé peptidy schopné spojiť konce dvoch rôznych duplexných fragmentov alebo zlomené konce lineárnych alebo kruhových reťazcov DNA. Pomocou DNA ligáz je teda možné vytvoriť lineárne aj kruhové duplexné molekuly DNA.
DNA helikázy.
Odvíja reťaze pomocou energie hydrolýzy ATP. Funguje ako súčasť komplexu, ktorý vykonáva pohyb replikačnej vidlice a replikáciu neskrútených vlákien. Niekoľko Zelicase môže pôsobiť spoločne na zvýšenie rýchlosti.
SSB- bielkoviny.
Jednovláknové väzbové proteíny destabilizujú helix, viažu sa na jednovláknovú oblasť, čím ju stabilizujú, t.j. časť jednovláknovej DNA je fixovaná.
DNA topoizomerázyjaAII, gyráza.
Keď sa DNA odvíja, molekula rotuje - zmena sekundárnych a terciárnych štruktúr. Tieto procesy sú katalyzované skupinou enzýmov nazývaných topoizomerázy. Zavádzajú jedno a dvojvláknové zlomy v DNA, čo umožňuje molekule nukleovej kyseliny rotovať a stať sa templátom. Podľa mechanizmu účinku sa rozlišujú topoizomerázy prvého (I) a druhého (II) typu.
Topoizomerázy typu I (v E. coli - swiveláza) - zavádzajú jednovláknový zlom do molekuly DNA, topoizomerázy typu II (v E. coli - gyráza) - vykonávajú dvojvláknový zlom v DNA a prenášajú vlákna DNA cez prestávka, po ktorej nasleduje zosieťovanie. Súčasne pri vykonávaní svojich funkcií topizomerázy zostávajú spojené s molekulou DNA. V týchto procesoch topoizomerázy využívajú tyrozínový zvyšok, ktorý vykonáva nukleofilný útok na fosfátovú skupinu DNA za vzniku fosfotyrozínu. V dôsledku toho sa enzýmy kovalentne naviažu na 5' alebo 3' konce DNA v mieste zlomu. Vytvorenie takejto kovalentnej väzby eliminuje potrebu vynaloženia energie pri obnove fosfodiesterovej väzby pri jednovláknovom prerušení v konečných štádiách reakcie. Topoizomerázy DNA typu I majú jeden katalytický tyrozínový zvyšok na molekulu monomérneho proteínu, zatiaľ čo diméry DNA topoizomerázy II obsahujú jeden katalytický zvyšok na podjednotku, čo vytvára postupný dvojvláknový zlom v molekule DNA.
Topoizomerázy fungujú ako pánty, ale ich pôsobenie je opačné. Topoizomerázy I, ktoré prerušujú jedno z reťazcov kruhovej superzávitnicovej DNA, odvíjajú reťazce a znižujú počet superzávitnic. Topoizomerázy II premieňajú uvoľnenú, nesuperzávitnicovú, uzavretú kruhovú DNA na superzávitnicu.
Etapy replikácie: iniciácia, predĺženie, ukončenie. Iniciácia tvorby nových reťazcov DNA. Primaza. Primosome. Ukončenie replikácie DNA a divergencia dcérskych helixov u prokaryotov.
Ukončenie replikácie v lineárnych genómoch. Problém replikácie lineárneho otvoreného fragmentu DNA. Teloméry a telomerické opakovania, telomerická slučka. telomeráza. Mechanizmus telomerázy. Vlastnosti replikácie eukaryotickej DNA. Replikóny eukaryotov.
Podobne ako v prípade biosyntézy iných bunkových makromolekúl sa proces replikácie konvenčne delí na tri hlavné etapy: iniciácia, predĺženie a ukončenie.
Prokaryotická replikácia
Zasvätenie
Najčastejšie je zastúpený chromozóm prokaryotov jediná superšpirálová kruhová molekula s jedným alebo dvoma počiatkami replikácie. Aby sa každé z dvoch reťazcov DNA stalo templátom pre syntézu nového reťazca, je potrebné, aby sa reťazce DNA narovnali a vzdialili sa od seba. Zistilo sa, že reťazce DNA sa neodvíjajú po celej dĺžke, ale na krátkom úseku. Tu sa tvorí replikačná vidlica, miesto duplikácie DNA.
Keď sa DNA odvíja, molekula rotuje - zmena sekundárnych a terciárnych štruktúr. Tieto procesy sú katalyzované skupinou enzýmov tzv topoizomerázy . Zavádzajú jedno a dvojvláknové zlomy v DNA, čo umožňuje molekule nukleovej kyseliny rotovať a stať sa templátom. Podľa mechanizmu účinku sa rozlišujú topoizomerázy prvého (I) a druhého (II) typu.
Iniciátorové proteíny „sedia“ na nekrútenej časti materskej molekuly DNA, z ktorej sa začína replikácia a ktorá sa nazýva počiatok replikácie (alebo počiatok, oriC). Iniciácia replikácie v oriC začína tvorbou komplexu, ktorý zahŕňa šesť proteínov DnaA, DnaB, DnaC, HU, gyrázu a SSB.
Po prvé, proteíny sa viažu na deväťnukleotidovú sekvenciu DNAA , ktoré tvoria veľký agregát. Pôvodná DNA ju obklopuje a vlákna DNA sú rozdelené do oblasti troch 13-mérových sekvencií. V ďalšom štádiu sa proteíny DnaB (helikáza) a DnaC spoja a vytvoria agregát s veľkosťou 480 kDa s polomerom 6 nm. Helicase/ DNAB zabezpečuje pretrhnutie vodíkových väzieb medzi dusíkatými bázami v dvojvlákne DNA, čo vedie k jej denaturácii, t.j. divergencia vlákien.
V dôsledku narovnávania a denaturácie dvojzávitnice DNA vzniká replikačná vidlica v tvare Y (obrázok). Práve na tejto replikačnej vidlici syntetizujú DNA polymerázy dcérske molekuly DNA. Tento kúsok DNA vyzerá ako bublina alebo „oko“ v nereplikovanej DNA. Replikačné „oči“ sa tvoria na tých miestach, kde sa nachádzajú počiatky replikácie. Keď sú vlákna DNA oddelené, molekula sa stáva celkom mobilnou. Všetky možné porušenia v štruktúre jednotlivých reťazcov sú vďaka akcii eliminované SSB proteíny
(jednovláknové proteíny viažuce DNA alebo proteíny destabilizujúce helix), ktoré väzbou na jednotlivé vlákna DNA zabraňujú ich zlepeniu. 
Je molekula dedičnosti, potom, aby si uvedomila túto kvalitu, musí sa presne kopírovať a tak zachovať všetky informácie dostupné v pôvodnej molekule DNA vo forme špecifickej sekvencie nukleotidov. Dosahuje sa to špeciálnym procesom, ktorý predchádza rozdeleniu ktorejkoľvek bunky v tele, ktorý sa nazýva replikácia DNA.
Podstatou replikácie DNA je, že špeciálny enzým rozbíja slabé vodíkové väzby, ktoré spájajú nukleotidy dvoch reťazcov. Výsledkom je, že vlákna DNA sú oddelené a z každého vlákna „trčia“ voľné dusíkaté bázy (vzhľad takzvanej replikačnej vidlice). Špeciálny enzým DNA polymeráza sa začne pohybovať po voľnom reťazci DNA od 5- po 3-koniec (vedúci reťazec), čím pomáha pripájať voľné nukleotidy neustále syntetizované v bunke na 3"-koniec novosyntetizovaného reťazca DNA. Na druhom vlákne DNA (zaostávajúce vlákno) sa tvorí nová DNA vo forme malých segmentov pozostávajúcich z 1000-2000 nukleotidov (Okazakiho fragmenty).
Na začatie replikácie fragmentov DNA tohto vlákna je potrebná syntéza krátkych fragmentov RNA (charakteristiky RNA budú uvedené nižšie) ako semien, na čo sa používa špeciálny enzým - RNA polymeráza (primáza). Následne sa odstránia priméry RNA a do vzniknutých medzier sa pomocou DNA polymerázy I vloží DNA. Každé vlákno DNA sa teda použije ako templát alebo templát na konštrukciu komplementárneho vlákna a replikácia DNA je semikonzervatívna (t.j. reťazec v novej molekule DNA je „starý“ a druhý je nový).
Bunka používa rôzne enzýmy na replikáciu vedúcich a zaostávajúcich reťazcov. Následkom replikácie vznikajú dve nové absolútne identické molekuly DNA, ktoré sú tiež zhodné s pôvodnou molekulou DNA pred začiatkom jej reduplikácie (proces replikácie DNA je bližšie znázornený na obr. 3.5). DNA polymeráza, ako každý iný enzým, výrazne urýchľuje proces pridávania komplementárnych nukleotidov do voľného reťazca DNA, avšak chemická afinita adenínu k tymínu a cytozínu k guanínu je taká veľká, že sa navzájom spájajú aj v neprítomnosti DNA polymerázy v jednoduchých reakčných zmesiach.
Trochu zjednodušene môžeme povedať, že fenomén presného zdvojenia molekuly DNA, ktorý je založený na komplementarite báz tejto molekuly, tvorí molekulárny základ dedičnosti. Rýchlosť replikácie DNA u ľudí je relatívne pomalá a replikácia DNA akéhokoľvek ľudského chromozómu by trvala týždne, ak by replikácia začala z jedného bodu. V skutočnosti, v molekule DNA akéhokoľvek chromozómu a každý ľudský chromozóm obsahuje iba jednu molekulu DNA, existuje veľa miest iniciácie replikácie (replikóny). Od každého replikónu replikácia pokračuje v oboch smeroch, kým sa susedné replikóny nezlúčia. Preto replikácia DNA na každom chromozóme prebieha pomerne rýchlo.
Replikácia (z latinského replicatio - obnova) je proces syntézy dcérskej molekuly DNA na matrici materskej molekuly DNA. Pri následnom delení materskej bunky dostane každá dcérska bunka jednu kópiu molekuly DNA, ktorá je identická s DNA pôvodnej materskej bunky. Tento proces zabezpečuje presné odovzdávanie genetických informácií z generácie na generáciu. Replikácia DNA sa uskutočňuje komplexným enzýmovým komplexom pozostávajúcim z 15-20 rôznych proteínov, nazývaných replikóm.
Replikácia DNA je kľúčovou udalosťou počas delenia buniek. Je dôležité, aby v čase delenia bola DNA replikovaná úplne a iba raz. Zabezpečujú to určité mechanizmy regulujúce replikáciu DNA.
Replikácia prebieha v tri etapy:
1. Spustenie replikácie
2. Predĺženie
3. Ukončenie replikácie.
K regulácii replikácie dochádza hlavne v iniciačnej fáze. Je to celkom jednoduché implementovať, pretože replikácia nemôže začať z akéhokoľvek úseku DNA, ale z presne definovaného úseku, ktorý sa nazýva miesto iniciácie replikácie. V genóme môže byť buď len jedno, alebo viacero takýchto miest. Koncept replikónu úzko súvisí s pojmom miesta iniciácie replikácie. Replikón je časť DNA, ktorá obsahuje počiatok replikácie a replikuje sa po začatí syntézy DNA z tohto miesta. Bakteriálne genómy sú typicky jediným replikónom, čo znamená, že replikácia celého genómu je výsledkom len jedného aktu iniciácie replikácie.
Eukaryotické genómy (ako aj ich jednotlivé chromozómy) pozostávajú z veľkého počtu nezávislých replikónov, čo výrazne znižuje celkový čas replikácie jednotlivého chromozómu. Molekulárne mechanizmy, ktoré riadia počet udalostí iniciácie replikácie na každom mieste počas jedného cyklu bunkového delenia, sa nazývajú kontrola počtu kópií. Okrem chromozomálnej DNA bakteriálne bunky často obsahujú plazmidy, čo sú jednotlivé replikóny. Plazmidy majú svoje vlastné mechanizmy kontroly počtu kópií: dokážu zabezpečiť syntézu len jednej kópie plazmidu na bunkový cyklus alebo tisícky kópií.
Replikácia začína v mieste iniciácie replikácie odvíjaním dvojitej špirály DNA, ktorá tvorí replikačnú vidlicu – miesto priamej replikácie DNA. Každá lokalita môže tvoriť jednu alebo dve replikačné vidlice v závislosti od toho, či je replikácia jednosmerná alebo obojsmerná. Obojsmerná replikácia je bežnejšia. Po určitom čase po začiatku replikácie je možné v elektrónovom mikroskope pozorovať replikačné oko - časť chromozómu, kde už bola replikovaná DNA, obklopená rozsiahlejšími úsekmi nereplikovanej DNA.
Na replikačnej vidlici DNA kopíruje veľký proteínový komplex (replizóm), ktorého kľúčovým enzýmom je DNA polymeráza. Replikačná vidlica sa pohybuje rýchlosťou asi 100 000 párov báz za minútu u prokaryotov a 500-5000 u eukaryotov.
Molekulárny mechanizmus replikácie:
Enzýmy (helikáza, topoizomeráza) a proteíny viažuce DNA odvíjajú DNA, udržiavajú templát v zriedenom stave a otáčajú molekulu DNA. Správna replikácia je zabezpečená presným párovaním komplementárnych párov báz a aktivitou DNA polymerázy, ktorá je schopná chybu rozpoznať a opraviť. Replikácia v eukaryotoch sa uskutočňuje niekoľkými rôznymi DNA polymerázami (na rozdiel od replikácie DNA v prokaryotoch).
DNA polymeráza I pôsobí na zaostávajúce vlákno, aby odstránila RNA primery a predreplikovala purifikované miesta DNA. DNA polymeráza III je hlavný DNA replikačný enzým, ktorý syntetizuje vedúci reťazec DNA a Okazakiho fragmenty počas syntézy zaostávajúceho reťazca (Okazakiho fragmenty sú relatívne krátke fragmenty DNA, ktoré sa tvoria na zaostávajúcom reťazci počas replikácie DNA). Ďalej sú syntetizované molekuly skrútené podľa princípu supercoilingu a ďalšieho zhutňovania DNA. Syntéza je energeticky náročná.
Vlákna molekuly DNA sa rozchádzajú, tvoria replikačnú vidličku a každé z nich sa stáva templátom, na ktorom sa syntetizuje nové komplementárne vlákno. V dôsledku toho sa vytvoria dve nové molekuly dvojvláknovej DNA, identické s rodičovskou molekulou.
Replikácia– prenos informácií z DNA do DNA, samoduplikácia DNA (biosyntéza DNA).
Molekula DNA pozostávajúca z dvoch helixov štvorhra počas delenia buniek. zdvojnásobenie DNA na základe skutočnosti, že pri rozpletaní nití je možné každú niť dokončiť doplnková kópia, čím sa získajú dve vlákna molekuly DNA kopírujúce tú pôvodnú.
Podmienky potrebné na replikáciu: 1.) Matrix- reťazce DNA. Rozdelenie nite sa nazýva replikačná vidlica. Môže sa tvoriť vo vnútri molekuly DNA. Pohybujú sa rôznymi smermi, tvoria sa replikačné oko. V molekule eukaryotickej DNA je niekoľko takýchto očí, každé má dve vidličky. 2.) Substrát. Plastový materiál je deoxynukleotid trifosfáty: dATP, dGTP, dCTP, dTTP. Potom sa rozpadnú až deoxynukleotidmonofosfáty, dve molekuly anorganického fosfátu s uvoľnením energie, t.j. sú zdrojom aj energie, A plastový materiál. 3.) Ióny horčík. 4.) Replikatívny enzýmový komplex. A) DNA – odvíjacie proteíny: - DNA-A(spôsobuje divergenciu vlákien); - helikázy(odštiepiť reťazec DNA); - topoizomeráza 1 A 2 (odvinúť sa za špirálou). Sú roztrhané (3",5")-fosfodiesterové väzby. Topoizomeráza 2 u prokaryotov sa nazýva gyráza. b) Proteíny, ktoré bránia spájaniu reťazcov DNA ( SSB proteíny). V) DNA polymeráza(katalyzuje tvorbu fosfodiesterových väzieb). DNA polymeráza iba predlžuje existujúci reťazec, ale nemôže spojiť dva voľné nukleotidy. G) Primaza(katalyzuje tvorbu „semena“ pre syntézu). Vo svojej štruktúre ide o RNA polymerázu, ktorá spája jednotlivé nukleotidy. d) DNA ligáza. 5.) Priméry- „semeno“ na replikáciu. Toto je krátky fragment pozostávajúci z ribonukleotid trifosfáty(2 - 10). Tvorba priméru je katalyzovaná prvoradý.
Fázy replikácie: 1.) Zasvätenie(tvorba replikačnej vidlice); 2.) Predĺženie(syntéza nových vlákien); 3.) Vylúčenie základného náteru; 4.) Ukončenie(dokončenie syntézy dvoch dcérskych reťazcov).
Spustenie replikácie:- reguluje molekuly signálnych proteínov rastové faktory;- poskytnúť enzýmy A špeciálne bielkoviny.
Potrebné enzýmy: DNA topoizomerázy- enzýmy, ktoré odvíjajú superhelixy DNA. DNA helikáza– štiepi vodíkové väzby v molekule dvojvláknovej DNA. Ako výsledok, replikačná vidlica (replikačné oko).
Jednovláknové proteíny viažuce DNA sa viažu na jednovláknovú DNA a bránia im v komplementárnom spojení.
Replikačné predĺženie. Syntéznymi substrátmi sú deoxynukleozidtrifosfáty, pôsobiace ako stavebné materiály a zdroje energie.
Potrebné enzýmy: DNA primárna, ktorý katalyzuje syntézu krátkych molekúl RNA primerov pre DNA polymerázu. DNA polymeráza zabezpečuje začlenenie do rastúceho „nového“ reťazca nukleotidov komplementárnych k „starému“, teda templátovému reťazcu.
Syntéza nových reťazcov DNA môže pokračovať iba v smere od 5' konca k 3' koncu. DNA sa syntetizuje nepretržite na jednom vlákne „vedúci“ reťazec a na ďalších sa tvoria krátke úlomky - „zaostávajúci“ reťazec (fragmenty Okazaki).
Po odstránení primerov DNA ligáza zošíva krátke úlomky Okazakiho ( ukončenie).
Informácie sa prenášajú maticová metóda. Polokonzervatívne mechanizmus replikácie DNA.
| Lagging Strand Synthesis |
| 3’ |
| 3’ |
| 5’ |
| 5’ |
DNA je spoľahlivým úložiskom genetických informácií. No treba ho nielen bezpečne uchovávať, ale aj preniesť na potomstvo. Od toho závisí prežitie druhu. Koniec koncov, rodičia musia odovzdať svojim deťom všetko, čo dosiahli v priebehu evolúcie. Zaznamenáva všetko: od počtu končatín až po farbu očí. Samozrejme, mikroorganizmy majú tejto informácie oveľa menej, no treba ju tiež prenášať. Za týmto účelom sa bunka delí. Aby sa genetická informácia dostala do oboch dcérskych buniek, musí sa zdvojnásobiť, čo je proces nazývaný „replikácia DNA“. Vyskytuje sa pred delením buniek, bez ohľadu na to, ktoré z nich. Môže ísť o baktériu, ktorá sa rozhodla premnožiť. Alebo to môže byť nová koža rastúca v mieste rezu. Proces duplikácie deoxyribonukleovej kyseliny musí byť jasne regulovaný a dokončený pred začatím delenia buniek.
Kde dochádza k zdvojeniu?
K replikácii DNA dochádza priamo v jadre (u eukaryotov) alebo v cytoplazme (u prokaryotov). Nukleová kyselina pozostáva z nukleotidov – adenínu, tymínu, cytozínu a guanínu. Oba reťazce molekuly sú postavené na princípe komplementarity: adenín v jednom reťazci zodpovedá tymínu a guanín cytozínu. Zdvojenie molekuly musí prebiehať tak, aby bol v dcérskych helixoch zachovaný princíp komplementarity.
Začiatok replikácie - iniciácia
Kyselina deoxyribonukleová je dvojvláknová špirála. K replikácii DNA dochádza pridaním dcérskych reťazcov pozdĺž každého rodičovského reťazca. Aby bola táto syntéza možná, musia byť špirály „rozmotané“ a reťazce od seba oddelené. Túto úlohu zohráva helikáza - odvíja špirálu kyseliny deoxyribonukleovej, ktorá sa otáča vysokou rýchlosťou. Začiatok duplikácie DNA nemôže začať z akéhokoľvek miesta, takýto zložitý proces si vyžaduje špecifickú časť molekuly – miesto iniciácie replikácie. Akonáhle sa určí počiatočný bod pre duplikáciu a helikáza začne svoju prácu na rozpletení špirály, vlákna DNA sa od seba oddelia a vytvoria replikačnú vidlicu. Sedia na nich DNA polymerázy. Sú to oni, kto bude syntetizovať dcérske reťazce.
Predĺženie
V jednej molekule deoxyribonukleovej kyseliny sa môže vytvoriť 5 až 50 replikačných vidlíc. Syntéza dcérskych reťazcov prebieha súčasne v niekoľkých častiach molekuly. Ale nie je ľahké dokončiť konštrukciu komplementárnych nukleotidov. Reťazce nukleových kyselín sú navzájom antiparalelné. Rôzne smery rodičovských reťazcov ovplyvňujú duplikáciu, čo určuje komplexný mechanizmus replikácie DNA. Jeden z reťazcov dieťa priebežne dopĺňa a nazýva sa vedúci. To je správne, pretože pre polymerázu je veľmi vhodné pripojiť voľný nukleotid na 3'-OH koniec predchádzajúceho. Táto syntéza prebieha nepretržite, na rozdiel od procesu na druhom reťazci.
Zaostávajúca reťaz, fragmenty O'Kazakiho
Ťažkosti vznikajú s druhým reťazcom, pretože tam je voľný 5' koniec, ku ktorému nie je možné pripojiť voľný nukleotid. Potom DNA polymeráza pôsobí z druhej strany. Na dokončenie dcérskeho reťazca sa vytvorí primer, ktorý je komplementárny k rodičovskému reťazcu. Vytvára sa na samotnej replikačnej vidlici. Tu začína syntéza malého kúska, ale po „správnej“ ceste - pridanie nukleotidov nastáva na 3' konci. Dokončenie reťazca na druhej dcérskej špirále teda prebieha diskontinuálne a má opačný smer ako pohyb replikačnej vidlice. Tieto fragmenty sa nazývali O'Kazakiho fragmenty a sú dlhé asi 100 nukleotidov. Po vytvorení fragmentu na predchádzajúci hotový kus sa priméry vyrežú špeciálnym enzýmom a miesto rezu sa vyplní chýbajúcimi nukleotidmi.
Ukončenie
Zdvojenie je dokončené, keď obe reťaze dokončia svoje dcérske reťaze a všetky fragmenty O'Kazakiho sú zošité. V eukaryotoch sa replikácia DNA končí, keď sa replikačné vidlice stretnú. Ale v prokaryotoch je táto molekula kruhová a proces zdvojenia prebieha bez predchádzajúceho prerušenia reťazca. Ukazuje sa, že všetka deoxyribonukleová kyselina je jeden veľký replikón. A duplikácia končí, keď sa replikačné vidlice stretnú na opačnej strane kruhu. Po dokončení replikácie musia byť obe vlákna materskej deoxyribonukleovej kyseliny opäť spojené, potom sa obe molekuly skrútia, aby vytvorili supercoils. Ďalej sú obe molekuly DNA metylované na adeníne v oblasti -GATC-. To neoddeľuje reťazce ani nenarušuje ich komplementaritu. To je nevyhnutné pre skladanie molekúl do chromozómov, ako aj pre reguláciu čítania génov.
Rýchlosť a presnosť replikácie
Druhá fáza zdvojenia (predlžovania) DNA nastáva rýchlosťou približne 700 nukleotidov za sekundu. Ak si pamätáme, že na jednu otáčku nukleovej kyseliny pripadá 10 párov monomérov, ukáže sa, že počas „odvíjania“ sa molekula otáča frekvenciou 70 otáčok za sekundu. Pre porovnanie: rýchlosť otáčania chladiča v počítačovej systémovej jednotke je približne 500 otáčok za sekundu. Ale napriek svojej vysokej rýchlosti DNA polymeráza takmer nikdy nerobí chyby. Koniec koncov, jednoducho vyberie komplementárne nukleotidy. Ale aj keď sa pomýli, DNA polymeráza ju rozpozná, urobí krok späť, odtrhne nesprávny monomér a nahradí ho správnym. Mechanizmus replikácie DNA je veľmi zložitý, ale podarilo sa nám pochopiť hlavné body. Je dôležité pochopiť jeho význam pre mikroorganizmy aj mnohobunkové tvory.
replikácia DNA- Ide o proces jej zdvojenia pred delením buniek. Niekedy hovoria „reduplikácia DNA“. K duplikácii dochádza v S fáze interfázy bunkového cyklu.
Je zrejmé, že samokopírovanie genetického materiálu v živej prírode je nevyhnutné. Len tak môžu dcérske bunky vzniknuté pri delení obsahovať rovnaké množstvo DNA, aké bolo pôvodne v tej pôvodnej. Vďaka replikácii sa všetky geneticky naprogramované štrukturálne a metabolické vlastnosti prenášajú počas niekoľkých generácií.
Počas delenia buniek každá molekula DNA z páru identických ide do svojej dcérskej bunky. To zaisťuje presný prenos dedičných informácií.
Syntéza DNA spotrebováva energiu, t.j. je to energeticky náročný proces.
mechanizmus replikácie DNA
Samotná molekula DNA (bez duplikácie) je dvojitá špirála. Počas procesu reduplikácie sa vodíkové väzby medzi jeho dvoma komplementárnymi vláknami prerušia. A na každej jednotlivej reťazi, ktorá teraz slúži ako šablóna-matica, je postavená nová reťaz, ktorá ju dopĺňa. Týmto spôsobom sa vytvoria dve molekuly DNA. Každý z nich získa jeden reťazec z DNA svojej matky, druhý je novo syntetizovaný. Preto je mechanizmus replikácie DNA polokonzervatívne(jedna reťaz je stará, jedna je nová). Tento replikačný mechanizmus bol preukázaný v roku 1958.
V molekule DNA sú reťazce antiparalelné. To znamená, že jeden závit ide v smere od 5" konca k 3" a doplnkový ide v opačnom smere. Čísla 5 a 3 označujú počet atómov uhlíka v deoxyribóze, ktorá je súčasťou každého nukleotidu. Prostredníctvom týchto atómov sú nukleotidy navzájom spojené fosfodiesterovými väzbami. A kde jedna reťaz má 3" spoje, druhá má 5" spojky, keďže je obrátená, čiže ide opačným smerom. Pre názornosť si môžete predstaviť, že si položíte ruku na ruku, ako keď prvák sedí v lavici.
Hlavný enzým, ktorý vykonáva rast nového vlákna DNA, to môže robiť iba jedným smerom. Totiž: pripojte nový nukleotid len na 3" koniec. Syntéza teda môže prebiehať len v smere od 5" do 3".
Reťazce sú antiparalelné, čo znamená, že syntéza na nich musí prebiehať rôznymi smermi. Ak by sa vlákna DNA najskôr úplne rozišli a potom by sa na nich vybudovalo nové komplementárne, potom by to nebol problém. V skutočnosti sa reťazce v určitom rozchádzajú počiatky replikácie a na týchto miestach matríc okamžite začína syntéza.
Takzvaný replikačné vidlice. V tomto prípade na jednom materskom reťazci syntéza prebieha v smere divergencie vidlice a táto syntéza prebieha nepretržite, bez prestávok. Na druhom templáte syntéza prebieha v opačnom smere ako je smer divergencie pôvodných reťazcov DNA. Preto k takejto reverznej syntéze môže dochádzať len v kusoch, ktoré sú tzv fragmenty Okazaki. Neskôr sú takéto fragmenty „zošité“.
Dcérske vlákno, ktoré sa nepretržite replikuje, sa nazýva vedenie, alebo vedenie. Ten, ktorý je syntetizovaný prostredníctvom fragmentov Okazaki, je zaostávanie alebo zaostávanie, pretože fragmentovaná replikácia je pomalšia.
V diagrame sa reťazce rodičovskej DNA postupne rozchádzajú v smere, v ktorom sa syntetizuje vedúci dcérsky reťazec. Syntéza zaostávajúceho reťazca ide v opačnom smere ako divergencia, takže je nútená prebiehať po častiach.
Ďalšou črtou hlavného enzýmu syntézy DNA (polymerázy) je, že nemôže začať samotnú syntézu, iba pokračovať. Potrebuje osivo alebo primer. Preto sa najprv na rodičovskom vlákne syntetizuje malý komplementárny úsek RNA a potom sa reťazec predĺži pomocou polymerázy. Neskôr sa základné nátery odstránia a otvory sa vyplnia.
Na obrázku sú semená zobrazené iba na zaostávajúcom vlákne. V podstate sú aj na čele. Tu však potrebujete iba jeden základný náter na vidličku.
Keďže vlákna materskej DNA sa nie vždy rozchádzajú od koncov, ale v bodoch inicializácie, v skutočnosti sa nevytvárajú ani tak vidličky ako oči alebo bubliny.
Každá bublina môže mať dve vidlice, t.j. reťaze sa budú rozchádzať v dvoch smeroch. Môžu však urobiť len jednu vec. Ak je napriek tomu divergencia obojsmerná, potom od inicializačného bodu na jednom reťazci DNA bude syntéza prebiehať dvoma smermi - dopredu a dozadu. V tomto prípade sa v jednom smere uskutoční kontinuálna syntéza a v druhom smere Okazakiho fragmenty.
Prokaryotická DNA nie je lineárna, ale má kruhovú štruktúru a len jeden začiatok replikácie.
Diagram ukazuje dve vlákna materskej molekuly DNA červenou a modrou farbou. Novo syntetizované vlákna sú znázornené bodkovanými čiarami.
U prokaryotov je samokopírovanie DNA rýchlejšie ako u eukaryotov. Ak je rýchlosť reduplikácie v eukaryotoch stovky nukleotidov za sekundu, potom v prokaryotoch dosahuje tisíc alebo viac.
Replikačné enzýmy
Replikáciu DNA zabezpečuje celý komplex enzýmov tzv replisome. Existuje viac ako 15 replikačných enzýmov a proteínov, z ktorých najvýznamnejšie sú uvedené nižšie.
Hlavným replikačným enzýmom je už spomínaný DNA polymeráza(v skutočnosti je ich niekoľko rôznych), čo priamo predlžuje reťaz. Toto nie je jediná funkcia enzýmu. Polymeráza je schopná „skontrolovať“, ktorý nukleotid sa snaží pripojiť na koniec. Ak to nie je vhodné, vymaže ho. Inými slovami, čiastočná oprava DNA, t.j. jej oprava chýb replikácie, nastáva už v štádiu syntézy.
Nukleotidy nachádzajúce sa v nukleoplazme (alebo cytoplazme v baktériách) existujú vo forme trifosfátov, teda nejde o nukleotidy, ale o deoxynukleozidtrifosfáty (dATP, dTTP, dGTP, dCTP). Sú podobné ATP, ktorý má tri fosfátové zvyšky, z ktorých dva sú spojené vysokoenergetickou väzbou. Keď sa takéto väzby prerušia, uvoľní sa veľa energie. Deoxynukleozidtrifosfáty majú tiež dve vysokoenergetické väzby. Polymeráza oddeľuje posledné dva fosfáty a uvoľnenú energiu využíva na polymerizačnú reakciu DNA.
Enzým helicase oddeľuje templátové reťazce DNA prerušením vodíkových väzieb medzi nimi.
Keďže molekula DNA je dvojitá špirála, prerušenie väzieb vyvoláva ešte väčšie krútenie. Predstavte si povraz dvoch povrazov stočených voči sebe a na jednej strane ťaháte jeden koniec doprava, druhý doľava. Tkaná časť sa ešte viac zvlní a bude pevnejšia.
Na odstránenie takéhoto napätia je potrebné, aby sa ešte neprerušená dvojzávitnica rýchlo otáčala okolo svojej osi a „resetovala“ výslednú superspiralizáciu. To je však príliš energeticky náročné. Preto je v bunkách implementovaný iný mechanizmus. Enzým topoizomeráza pretrhne jednu z nití, prevlečie druhú cez medzeru a prvú opäť zošije. Takto sa eliminujú výsledné supercoils.
Templátové reťazce DNA, ktoré sa oddelili v dôsledku pôsobenia helikázy, sa pokúšajú opäť spojiť so svojimi vodíkovými väzbami. Aby tomu zabránili, konajú DNA viažuce proteíny. Nie sú to enzýmy v tom zmysle, že nekatalyzujú reakcie. Takéto proteíny sa pripájajú k reťazcu DNA po celej jeho dĺžke a zabraňujú uzavretiu komplementárnych reťazcov templátovej DNA.
Priméry sa syntetizujú RNA primárna. A sú vymazané exonukleáza. Po odstránení základného náteru sa otvor vyplní iným typom polymerázy. V tomto prípade však nie sú jednotlivé časti DNA zošité.
Jednotlivé časti syntetizovaného reťazca sú zosieťované replikačným enzýmom ako napr DNA ligáza.
